「STAP細胞の非実在について＃３」記事へのコメント

データの読み方

[Anonymous Coward]

kahoさんが本文中で示されたデータから、
「CD45+細胞だけがOct4-GFPのトランスジェニックマウスで，それ以外は違う細胞を使っています」
との結論に至る理由がわからないのですが、どなたか説明できますか？

Oct4-GFP TgマウスはOct4プロモータにGFPをつないだトランスジーンをゲノム上に複数個有するマウスだと理解しています。
解析例はChIP-Seqのinput リードをマウスのリファレンス配列にマッピングした結果だと思いますが、
Oct4プロモータ領域の配列だけが極端に多く読まれている、ということでしたら先の結論も納得できるのですが、そのような図には見えません。

私は理研とは全く関わりがありませんし、小保方氏の論文についても懐疑的ですが、気になったのでコメントさせていただきました。

Re:データの読み方

[Anonymous Coward]

Dr. Knoefplerのブログのコメントに以下のリンクがありました。これはKahoさんがゲノムデータから解析した事実はすでに著者らが公表しているということでしょうか？
何故Strainの異なるマウスから得たサンプルをコントロールとして使用したのか、全くわかりません。少なくとも実験系としてはきちんとコントロールされておらず、低レベルの杜撰なデータ解析であることは明らかです。

CD45+cell(derived from Oct3/4::gfp C57BL/6)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393440 [nih.gov]
ESCell(derived from C57BL/6 x 129/sv )
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393446 [nih.gov]
STAP Cell(derived from C57BL/6 x 129/sv)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393449 [nih.gov]
STAP Stem Cell (derived from C57BL/6 x 129/sv)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393452 [nih.gov]

Re:データの読み方

[Anonymous Coward]

Nature LetterにはChip/RNA-seqのFigがあり、一方、Nature ArtcileにはChip/RNA-seqのFigが無いし本文でも言及されてない。それにも関わらずArtcileにもLetterと同様Chip/RNA-seqの方法が記載されている。ということでいいでしょうか？

ArticleでのBisulphite sequencingによるDNAメチル化解析(Fig2c)や、qPCR解析（Fig.2b）は、Oct4-GFP+のSTAP細胞をFACSで選別して実験している。一方、Chip-seq, RNA-seqでは、B6GFP(cag-gfp transgene) × 129/Svマウス由来である可能性が高く、Oct4-GFP+のSTAP細胞が選別されているわけではない。ということでよろしいでしょうか？

今、Nature LetterのFig4のChip-seq解析においてCD45+細胞だけが異なる種類のマウスを用いていることが問題になっているようですが、ただ、この図で著者らが言いたい事は、STAP, ES, STAP-SCと、FI-SC, TSとの間のヒストンメチル化パターンの違いのようです。ですので、著者らはNature LetterのFig4のChip-seq解析において、CD45+細胞は重要でないコントロールだったと弁明するかもしれませんね？もちろん、厳密に言えば、STAP, ES, STAP-SC, FI-SC, TSとマウスの種類を揃えるべきだったのかもしれませんが？

Nature LetterのFig4
http://www.nature.com/nature/journal/v505/n7485/fig_tab/nature12969_F4.html [nature.com]

Re:

[Anonymous Coward]

# 専門外なので外したコメントをしているかもしれませんが…

今、Nature LetterのFig4のChip-seq解析においてCD45+細胞だけが異なる種類のマウスを用いていることが問題になっているようですが、

問題となっているのは、Fig.2 のi, Extended Fig.3 の b と c、およびこれらに関する一連の記述で、
これらの図では CD45+ と STAP cells (また CD45+ と ES cells) に差があるように見えていますが
kaho 氏が http://srad.jp/journal/578591 [srad.jp] で指摘しているように、
「その原因が酸の処理が原因なのか遺伝子の違いによるのかが分かりません」、
ということだと思います。

# というか、そろえて実験すると、CD45+ と STAP cells が同じクラスタに入るんじゃないかと…

Re:

[Anonymous Coward]

Fig.2 のi, Extended Fig.3 の b と c などは、Chip-seqではなく、RNA-seqのデータに基づいた図ではないでしょうか？
Chip-seqでは、CD45+細胞だけ、雄でOct-GFPマウス由来なのですが、
RNA-seqでは、CD45+細胞も、C57BL/6 x 129/svマウス由来で、STAP細胞、STAP-SC細胞も、C57BL/6 x 129/svマウス由来です。
（ただ、 TS cell は、CD1strain由来のようなので、それは問題かもしれません。）

BioSample: SAMN02393426; Sample name: CD45+ cell RNA-seq; SRA: SRS559080
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393426 [nih.gov]

RNA-seqデータ一覧：

Re:

[Anonymous Coward]

DNAseqおよびRNAseqのSTAP細胞、STAP幹細胞の両方とも、データベースでの説明をみると、

strain C57BL/6 x 129/sv
development stage Oct3/4 expressing cells

とありますね。
kahoさんの指摘どうり、C57BL/6 x 129/sv　が、cag-GFPマウスだとしたら、
Oct3/4 expressing cells　をFACSでGFPで選別できませんよね？
選別していなけど、development stage Oct3/4 expressing cells　と書いたのでしょうか？論文の本文中には何も述べられてないので、よくわかりませんが。

DNA-seq
STAP Cell(derived from C57BL/6 x 129/sv)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393449x [nih.gov]
STAP Stem Cell (derived from C57BL/6 x 129/sv)

Re:

[Anonymous Coward]

ご指摘ありがとうございます。

確かに
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393440 [nih.gov]
と
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393426 [nih.gov]
とで、異なった由来が記載されていました。

てっきり、ChIP-seq と RNA-seq で同じ検体を用いているものと思っていました。
# このようなことは良く行われることなのでしょうか?

Re:

[Anonymous Coward]

あっ、ちょっと待って下さい。
この "strain" の記述の信憑性はどのくらいあるのでしょうか?
# 単に著者の自己申告ということだとちょっと引っかかります。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393440 [nih.gov]
と
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/2393426 [nih.gov]
が異なる検体で実験されたということを確認できる解析手法などはないのでしょうか?

Re:

[Anonymous Coward]

＞CD45+細胞は重要でないコントロールだったと弁明するかもしれませんね？

「STAP, ES, STAP-SCと、FI-SC, TSとの間のヒストンメチル化パターン違いをみる」ために必要な一番重要なネガコン（その他の細胞と比べて一番差の大きいことが予想されるサンプル）な気もしますね。

あんまり詳しくないのですが、starinが違う場合に、Chip-seqで、H3K4, H3K27のメチル化パターンを比較することは可能なんでしょうか？

あと継代数にもよるでしょうが、C57BL/6 x 129/svのmixed backgroundの場合、実験によっては個体差（この場合個々のマウスに由来

Re:

[Anonymous Coward]

これ私もみました。コメントに引用してある理研プロトコールの文章、“C57BL/6 carrying Oct4-gfp (29 of 29), 129/Sv carrying
Rosa26-gfp (2 of 2), and 129/Sv × C57BL/6 carrying cag-gfp (12 of 16)”.から推測すると、

CD45＋細胞がOct4-gfp由来,
STAP細胞,STAP-幹細胞,ES細胞がcag-gfp由来であることが疑われ、

kahoさんの分析通りな気がします。

なぜ一部の細胞だけOct4-gfp由来なんでしょうか？
少なくともノプラーさんのところのコメントにもあるように、ES細胞のコンタミの可能性を否定する証拠としては弱い気がします。