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日記

kahoの日記: STAP細胞の非実在について#5 123

日記 by kaho

とりあえず論文が撤回の方向に進んでいるようでいくらか安心しました.
真相の解明までいくか分かりませんので,10%程度の安心ですが.
誤解を受けないように明記しておきますと,今日までこの解析を行うにあたって私は一切の圧力も感じませんでしたし,協力してくださった皆さんのおかげで大変助けられました.頭に血が上った上に何の制限もなかったおかげで,周りが見えなくなって大失敗もしましたが.
一段落したことで今回がSTAPについて書く最後になるかと思います.今回の大本のメディアからも問い合わせを受け,本名を出しても構わないと返答しましたので,これからはコメントをするとしても公式な手続きを踏んだものになるかと思います.

”input”の解析でまだここに書いていなかったものとして,CNV(copy number variation)解析を最後に書き留めます.
これはChIP-seqの”input”データという限られた配列でどこまでできるか自信がなかったので,様々な計算方法を試し,基準となりそうなデータを探したりその著者に問い合わせたりして時間がかかる作業でした.
CNVというのは,ゲノム中で生じるコピー数の変化のことで,単純な繰り返し配列が細胞分裂の際に伸びたり縮んだりする現象のことを言います.個体間の差を見る方法として,SNP (single nucleotide polymorphism)がよく知られていますが,それよりもはるかに変化しやすく,同じ個体の細胞でも違いがみられます.

STAP細胞の由来を調べるために,当初私はSNPの違いを見ようとしたのですが,変異が少ないために定量的な評価はできませんでした.SNPがあるように見えてもその配列が正しいかを確定させるためには同じ場所を何回も読んでいる必要があるのですが,”input”はそこまでの量の配列はないので,個々の細胞の配列を決めることも難しいのです.
しかし,ゲノム上に配置された配列をよく見ていくと,多くの場所で配列が多数積み重なっている場所があります.また,CD45+細胞(Oct4-GFP)とSTAP/STAP-SC/ESで違いがあることが分かり,これはCNVを観察しているのだろうと予想しました.ChIP-seqのリード数でもCNVが評価できるのだとしたら,個々の細胞の近縁関係が分かるかもしれないと考え,ここから情報を得るためにいくつかの試行錯誤を行いました.

結果として,以下の単純(≒ロバスト)な方法でうまく行きそうだという感触を得ましたので,非常にテクニカルになりますが,再現実験を試みる人のために記します.

・染色体を50, 100, あるいは250塩基ごとのウィンドウに分割する.
・2つのゲノム間で,同じウィンドウ間のリード数を数える.
・ウィンドウ内のリード数をカウントし,性別が異なってもよいよう,各染色体ごとの総リード数を用いてオッズ比を算出する.また,性染色体は計算から除外する.
・オッズ比の95%信頼区間を計算する.
・オッズ比が1より大きい場合は信頼区間の下限値が2より大きいもの,オッズ比が1未満の場合は信頼区間の上限値が0.5未満のものを「CNVの差がある」区間としてカウントする.
・ただし近接している領域は結合させて1つと数える.
・このCNVの違いを2つの細胞の距離として評価する.

この計算で一定の数字が得られることは分かりますが,そこで得られた距離をどう解釈するかは,別の基準がなければなりません.今回,おおよそリード数が同じ(数割少ない)で,世代をまたいだり同一個体から別組織を得たりしたデータを取得しているXiao(3/11 10:13訂正)らの論文(Cell, 2012, GSE36114)GSE36294(Chang et al., Cell Res. 2014)(3/11 13:11再訂正)のデータを用いました.著者らにコンタクトを取り(ついでにデータベースから論文へのリンクが貼られていないことを修正してもらい),個々の細胞の由来を聞いた所,1-MEF-iPSからマウスを作成し,2-APC, 2-HPCという細胞をそのマウスから得たことを確認しました.
このデータを使うことで,最初の幹細胞と分化した細胞の変異,体細胞ごとのCNVの違いが分かります.

今回,目立ったCNVが100塩基未満だったこと,50塩基では統計上サンプルが少なくて評価ができにくかったことから,ウィンドウサイズが100塩基の時の計算結果を示します.
結果を示しますと,以下のようになります.どの細胞の組み合わせでもCNVが観察出来ました.

          2-HPC*   2-HPC   2-APC
1-MEF_iPS     76     141     255
2-APC        151     160
2-HPC         16
2-HPC*

次に,この手法をSTAP論文のために公開されたデータに使います.この結果は以下の通りになりました.

        ESC STAP-SC  STAP  FI-SC    TSC
CD45+   245    270    277    182    669
TSC     420    459    360    371
FI-SC    17      6     17
STAP      0      2
STAP-SC   6
ESC

これまで見てきた通り,CD45+細胞はSTAP/STAP幹細胞/ES細胞とは由来が異なることがこの解析でも分かります.
また,ES細胞とSTAP細胞はCNVに差がなく,ほぼ同一であることが示されました.この近さは慎重な実験をするために,STAPを抽出したマウスからES細胞を作成したとしても説明がつかないように思われます.

どのような原因でこういった結果になったかは特に論評しません.
ChIP-seq実験をするときにサンプルを間違えて,同じ細胞を4回使ってしまったのかもしれません.
著者らが再現実験をするときは,慎重に実験をしていただきたいと思います.

この議論は賞味期限が切れたので、アーカイブ化されています。 新たにコメントを付けることはできません。
  • もしES細胞あるいはそれにきわめて近いものが使われているとなった場合は、その出所もわかるのでしょうか?つまり、マウスES細胞を小保方さんが作れるとも思えない。現在は売ってもいるそうですが、買うには、前もって倫理委員会への申請とかいるのでは?そのES細胞がどこから出たものか、誰が渡したものかまで分かるようになっているのですか?

    • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 4時18分 (#2560622)

      2chではこんな書き込みもありましたが・・・・・

      685 : 名無しゲノムのクローンさん [] 2014/03/03(月) 23:03:33.46
      ESを胎盤に分化させる事が出来たのが、共著者のniwaさんの仕事だと、
      西川センセがニコ堂で言ってたね。
      niwaさんの仕事が追試されただけだったりして...。
      686 : 名無しゲノムのクローンさん [sage] 2014/03/03(月) 23:04:30.53
      >>685
      つーか、niwaさんのESを使えば再現できる時点で
      やばやばなんだよな
      共著者だしniwaさん

      親コメント
      • まあ、私の質問はkahoさんに共犯者を名指せと言っているようなもので、もともと無理があったかもしれません。
        丹羽さん作成のES細胞については、慶応大の吉村教授も同様に西川さんからの伝聞を挙げておられます。
        >一番心配なのはすべてを合理的に説明できるESの混入だ(ESは胎盤にならないとされているが、西川先生の話では理研では胎盤にまでなれるESも開発されているらしい)。
        http://new.immunoreg.jp/modules/pico_boyaki/index.php?content_id=350 [immunoreg.jp]
        しかし、一方で、若山さんは以前ネイチャーへの返信で、胎盤にまでなるのは小保方さんが作った幹細胞だけだと言明しておられます。そこが特徴だと。
        >He also notes that the cells produced by Obokata are the only ones known — aside from those in newly fertilized embryos — to be able to produce, for example, placentas, so could not have been substituted cells.
        http://www.nature.com/news/acid-bath-stem-cell-study-under-investigati... [nature.com]

        このふたつの命題を両方成り立たせるためには、小保方=丹羽でないとならない。それがプロトコールのコレスポが丹羽さんだったことの理由でもあるんですかね。先走りました。

        親コメント
        • 上記に関連しますが、丹羽さんやケンブリッジ大スラニー?のES細胞が胎盤にまでなるというのはすでに科学的成果として確認された事実なのでしょうか?上記の吉村さんや西川さんの言い方ではまだ伝聞や第一報告にすぎないようにも聞こえるのですが。

          こうなってくると、そっちも捏造ではないかと疑わない理由はありません。
          >STAP細胞はiPS細胞やES細胞ではほとんど作れない胎盤にもなる
          (理研外部評価委員スミス・ケンブリッジ大教授)
          http://apital.asahi.com/article/story/2014030600005.html [asahi.com]

          ES細胞は胎盤にもなる、ならない、どっちの言説もまだ流通しているように見えます。しかも、なる派もならない派も、ちょっとだけなる、ほとんどならないみたいなあいまな表現。もうー、全員詐欺師か?

          ここにきて、このSTAP論文騒動の背景にはiPS派とES派の争いがあることだ段々分かってきているので、「ESの優位性」を示す言明については厳しく問わねばなりません。

          親コメント
        • 自己レスです。3月14日の会見によると、マウスES細胞は特別な管理はしていない、誰でも持ち出せる状態だったみたいですね。

          親コメント
  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 11時27分 (#2560760)

    私は専門外ですがkahoさんの説得力ある解析に興味を持って勉強中です.最初にkahoさんが示された方法でTCR alpha, TCR beta付近の数Mbpの範囲をみるだけでも,CD45+だけが特別でES/STAP-SC/low-ph処理の3個はかなりちかい(とくにESとSTAP-SCが近い)というのはクラスタリングでみえました.今回のCNV解析はゲノムワイド調べて,もっと確実に判定したいという方向でしょうか.

    TCR alphaはposition=54,000,000付近,TCR betaはposition=41,500,000付近をみるとCD45+だけ下がっていて,このプロットの範囲のデータでクラスタリングするときれいに分かれました.図を4枚添付します.

    http://postimg.org/image/tizwl3me7/ [postimg.org]

    http://postimg.org/image/8xl4t74tb/ [postimg.org]

    http://postimg.org/image/yixct1s0v/ [postimg.org]

    http://postimg.org/image/rbvnx6h3z/ [postimg.org]

    データ処理は
    http://d.hatena.ne.jp/biochem_fan/20140306/1394127619 [hatena.ne.jp]
    の方法です.

    • データ処理の方法を書いた biochem_fan です。

      私のブログを参考に試していただけたのはありがたいのですが、
      この解析では {STAP, STAP-SC, ESC} 同士の関係は CD45+ との
      関係よりも近いということは言えるとしても、{STAP, STAP-SC, ESC} が
      同じ細胞に由来するということを断定することはできません。

      depth の低さによるノイズが多いうえ、この近さが C57BL/6 x 129/sv という共通の
      遺伝的背景に由来するものなのか、それ以上に近いのかという判断できないからです。
      (CD45+ だけは C57BL/6 純系由来なので、他3つよりも遠くて当たり前)

      kaho 氏の方法は、CNV というよりノイズが少ないシグナルに着目したこと、
      別の文献から継代中に蓄積する CNV の量の見積もりを得たことで、この問題を
      解決しているように思われます。

      kaho さん、すばらしい解析、お疲れさまでした。

      親コメント
      • コメントありがとうございます.kahoさんの分析は,別の論文のデータをつかって適切なコントロールを得たことがすばらしいですね.CNVに着目してオッズ比の閾値を設定してるところもすばらしいですが,本当にCNVを計測できてるかについては検討が必要かもしれません.統計量の取り方については議論の余地があると思います.

        親コメント
    • by Anonymous Coward

      興味深いですね。
      こういった解析データをマスコミももっと紹介してくれると良いのですが。。

  • データセット (スコア:2, すばらしい洞察)

    by Anonymous Coward on 2014年03月11日 12時29分 (#2560786)

    ”Xiao(3/11 10:13訂正)らの論文(Cell, 2012, GSE36114)”

    Chang, Cell Res, 2014, GSE36294の間違いではありませんか?

    • その通りでした.すみません.訂正します.

      --
      kaho
      親コメント
      • by Anonymous Coward

        ここに書くのも何ですが、せっかくkahoさんがデータを子細に検討すれば(コピペや画像の使い回しの痕跡を探し回らずとも)
        論文の価値を判断できるという可能性を示されたのに、「kahoさんは信頼できる人のようだからよくわからないけれどここに
        書かれた内容は正しいのだろう」と判断して疑問を持たない人が多いように感じられることをいささか寂しく思ったりもします。

  • by fukapon (4131) on 2014年03月11日 1時18分 (#2560591) ホームページ

    今日のニュースを見て、やったんだなって思いました。
    まだ途中でしょうから、ご武運をお祈りしております。

    残念ながら、テクニカルな話はわからないんですが。

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 1時51分 (#2560599)

    CNVによる解析、興味深いですね。

    専門外なので詳細はわかりませんが、同じ遺伝的なバックグラウンドのマウスをつかっても、

    造血肝細胞(HPC)とiPS細胞(MEF_iPS)の差が76あるにもかかわらず、

    血液由来のSTAP細胞(STAP幹細胞ではない)及びSTAP幹細胞とES細胞との差が0,6

    とかなのがおかしいということなのですね。

    STAP細胞(STAP幹細胞ではない)にES細胞がちょっとコンタミしているというのではなく、

    STAP細胞までもが、全てES細胞だっとということなのでしょうか?

    ES細胞もふくめ、STAP,STAP-SCその他の細胞のバックグラウンドが129XB6なのもちょっと不明でしたね。

    ES細胞の由来は、何なのでしょうか?以前にkahoさんが指摘されていたように、CAG-GFP?
    kahoさんの解析でそのあたりは同定できるのでしょうか?

    • by Anonymous Coward

      今となっては若山教授の「私はSTAP-SCを129B6GFPマウスから樹立しました。その当時、我々はその系統のES細胞を持っていませんでした。」というコメントって意味深ですね(http://tokyocicada.blog.fc2.com/blog-entry-63.html)。

  • by Anonymous Coward on 2014年03月12日 4時27分 (#2561329)

    まず、STAP細胞の存在についてどうか以前に、あまりに論文の間違いが多いのでその時点で科学雑誌としてなりたっていないのは確かであり、論文の撤回は当然のことである。次にTCRについては、当時Natureのインパクトを挙げる為の虚偽であった事は確かであろう。最後にSTAP細胞の存在については、論文および彼女の公開しているこれまでのデータがあまりにいいかげん過ぎるので、もはや存在の有無を議論できる段階にすらないといえる。つまり、D論からもわかるように彼女はあまりに論文というものを重要視していないようにみえ、その結果もしかしたら本当は実在しているにもかかわらず、それを第三者に伝える形で論文を作っていないようにすらみえる(もしそうだとしたら共著者に対する冒涜もいいところである)。それぐらいレベルの低いねつ造というか間違ったデータの示し方である。めんどくさいからやったと思ってしまうレベルの内容である。したがって、Kahoさんが分析するのに用いた基データすべてがいいかげんであり、科学を議論できるレベルにないとすれば、STAP細胞の存在については今の所有るも無いも言えない。まずは、科学を議論できる、つまりは真実のデータなくして何も言えないのが現状だと思う。最大のポイントは著者を信じられなくなった時点で何も言えない。信頼が大切なこの世界におけるこの事件はあまりに大きく、撤回しなくてもSTAPのNatureの価値はすでにないし、もしSTAPが存在したとしても彼女は科学者としての信頼を取り戻すことは難しいだろう。

  • もうひとつの可能性を考えてみました。
    この塩基配列のデータがほんとに小保方さんがやった実験のデータならば、STAP=ESの可能性もあるのですが、
    もともと成功したSTAP細胞の実験などないなら、生データを出せとうるさくせっつかれて、写真やなんかと同じように、生データも他人がやった実験のものをどっかからパクってきて、挙げたとうたら、ふつうにESのデータであるのは不思議でもなんでもない。STAPがESに似てるのではなく、たんにESの実験データなのでは。誰か他の人のやった。

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 1時39分 (#2560594)

    ってメディアに言われると思うので考えてたほうがいい。

    • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 3時05分 (#2560609)

      学者のいうことを、他の学者に聞くなどしてわかりやすく説明できないなら、
      メディアってなんのために居るんです?

      親コメント
      • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 9時22分 (#2560687)

        その結果本人の意図とは違う解説が出回ったりなんて事を考えると本人が最初に説明する時点で分かりやすく話したほうがいいと思う。
        マスコミの発表が的外れでも俺には関係ないって本人が思うなら別にいいんだろうけど、とてもそう思ってるとは思えない。

        難解な説明した挙句TV出演してるおっさんが意味不明なことコメントするのが目に見えてる

        親コメント
    • by Anonymous Coward

      phason氏はそういうの上手そうだな。残念ながら分野が違いそうだけど。

    • by Anonymous Coward

      改変すれば できあがり!?

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 1時41分 (#2560596)

    どのような原因でこういった結果になったかは特に論評しません.
    ChIP-seq実験をするときにサンプルを間違えて,同じ細胞を4回使ってしまったのかもしれません.
    著者らが再現実験をするときは,慎重に実験をしていただきたいと思います.

    もしそういう方向に行きそうなのであれば、これはもう CDB はロックアウトして第三者機関の調査を入れないといけなくなると思います…

    今回の大本のメディアからも問い合わせを受け

    Nature ですか?

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 1時43分 (#2560597)

    私からもGood job!
    kahoさんの解析、大変参考になりました。真摯に科学的視点から問題を追究される姿勢に勇気をもらいました。
    しかしくれぐれも最後まで、気を付けてくださいね!
    割と近くから応援させていただきます。

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 2時42分 (#2560608)

    バイオインフォマティクスは委託するばかりで、データも満足に活用できていない研究者ですが、kahoさんのブログを読んで随分勉強になりましたし、面白いものだと思うようになりました。
    今回の件は、理由、目的全てをできる限り明らかにして、膿を出し切って欲しいです。
    まだまだ有志の方々のご尽力が必要だと思いますので、休息を取りつつがんばっていただきたいと思います。
    kahoさんの姿勢に胸が熱くなりました。
    最後まで応援します。

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 7時05分 (#2560633)

    自主的に撤回出来るのは、今日3.11がタイムリミットでしょう。今晩にも海外からの圧力がかかってくる可能性も。

    • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 11時33分 (#2560766)

      小保方さん本人とバカンティ教授がこの期に及んで、必死で抵抗しているようですね。
      Natureの規定によれば、著者全員の同意がなければ論文は撤回できないんでしょう?
      どうなるのだろうか。

      ●「撤回理由ない」と米教授 STAP細胞論文、共著者
      米紙ウォールストリート・ジャーナル電子版は10日、理化学研究所が撤回も検討している「STAP細胞」の論文について、共著者のチャールズ・バカンティ米ハーバード大教授が「私が持っている情報に基づけば、論文が撤回されなければならない理由は見あたらない」と語ったと報じた。

       バカンティ氏は、論文の主執筆者である理研の小保方晴子研究ユニットリーダーの元指導教官。同紙によると、バカンティ氏は小保方氏と10日に話したことを明らかにした上で「(論文に)いくつかの誤りがあったが、結論には影響しない」と述べ、さまざまな組織に分化するSTAP細胞を作ったとの研究結果の正しさを訴えた。小保方氏も同じ立場だと説明した。

       論文には画像や表現に不自然な点が指摘され、共著者の一人、若山照彦・山梨大教授が「信用できなくなった」と撤回を呼び掛けた。バカンティ氏は「仲間からの圧力でこのような大事な論文が撤回されるとすれば大変残念だ」と話した。(共同)
      http://www.sponichi.co.jp/society/news/2014/03/11/kiji/K20140311007753... [sponichi.co.jp]

      親コメント
    • by Anonymous Coward

      これだけの証拠が揃って、既に遅過ぎる。

      著者と理研は、我が国の科学技術を貶める論文を、
      いつまで世界に晒しておくつもりなのか。

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 9時05分 (#2560680)

    ちょっと、うがった見方をしても良いですか?

    いくらなんでも自分の博士論文の時に使った写真をNatureの論文に使うでしょうか?実は、このねつ造のストーリーはS氏とN氏がしたてあげて、それから逃れられなくなったO氏がささやかな抵抗をした、と考えられなくはないでしょうか?誰か気づいてくれ、と。先週のprotocolの発表、そのあとの理研の対応を見ているとそんな気もしてきました。

    • by Anonymous Coward

      あんなにキラキラした瞳でプレスを前にプレゼンしてたんですよ?
      ありえない。

      いくらなんでも、ってことを山ほどやらかしてしまう特殊能力者なのですよ、彼女は。

    • by Anonymous Coward

      ここ一番のところで使うお気に入りの写真だったんじゃないのでしょうか。
      そもそもD論からして不正が疑われているのですよ。今回だけが不正が疑われる論文ならば周りのせいかもと思いますが、
      彼女の数少ない論文のほとんどがなんらかの疑いをもたれるものであるのだから、本人の問題じゃないのかな。

    • by Anonymous Coward

      人間をなめすぎです。純粋な動機だとしても、これぐらいのことはやりかねないのが人間です。
      彼女はきちんとした訓練を受けていない、もしくは、嘘で塗り固めた人生を歩んできたかのどちらかだろうと推測しています。

      彼女自身は、未だにSTAP細胞の実在を信じている可能性すらあるでしょう。
      自分の直感を信じきって、これまでやってきたのでしょうから。

    • by Anonymous Coward

      小保方さんに不正があったという流れだが、本当にそうかもしれないが、

      ただ、今の世の中の、情報操作って凄いからね。白いものを黒にしてしまうからね。

      STAP細胞は触れてはいけないものだったのかもしれない。
      最初はジャブ程度で論文撤回を求められたが、それに応じないと徹底的に潰された。

      その流れを見ているとおもしろいよね。

      昨日の画像転用は決定的だと思うけど、なぜあれだけ騒がれてたのにあの核心部の転用が今頃わかるの?

      STAP論文は目だち過ぎて第3者が偽造できないけど、博士論文は可能かな。また若山教授もおかしいよね。善良な第3者になっているけどキメラマウスの確認なんてあの人の仕事じゃなの。

      • by Anonymous Coward

        過去に発表済みの論文が書き換えられたって言うのかい?
        証拠を示したまえよ。

    • by Anonymous Coward

      黒か白かでもないかもしれませんよ。

      しかし、基本的に、バレる捏造で得をするのは彼らに対立している人だけだということは
      忘れてはいけないように思います。

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 16時47分 (#2561021)

    kaho先生good job!
    obokata先生、Vacanti先生、往生際悪い。
    Juuichijigen先生すごすぎる。鋭利で強靭な知性、素粒子理論家ですよね、きっと。
    ...Juuichijigen先生こわひ...

  • by Anonymous Coward on 2014年03月11日 23時09分 (#2561246)

    おそらく、ここは、理科的に、科学的に、正しいかどうかを述べるためだけのブログだったのに、いらんこと書いてしまいましたね。
    お詫びしておきます。

    科学的な話としては、おそらく・・・

    1、本件で問題となった論文(理研研究でできたSTAP細胞を、Y大学Y氏がさらにマウス実験)・・・STAP細胞って何者?(後述2との混合論文??)そもそも存在するのか???ES細胞系???
    2、ニュースで出ている小保方氏の博士論文→これはSTAP細胞ではない???ES細胞系???
    3、確定しているiSP細胞(京都大学)
    4、ES細胞

    の話でまとめるとわかりやすいですよね。

    でも、基盤の理研のSTAP細胞確定の研究が崩れると、アメリカのハーバード大学研究チームやB教授のチームはどうなるのでしょう???そういう意味では理研のうろたえている状況は分かります。それとも、STAP細胞はあるが、それを確定するための論文が単純に悪かった、という落ち?

    あるいは、STAP細胞ではないが、ES細胞の変化形の物が存在し、それをハーバードが利用しているわけなのか?さらにいえば、小保方氏の博士論文のほうが現在の理研のより優れており、小保方博士論文細胞(あるいはその変形)をハーバードが利用?小保方パニック?

    ・・・もう少し熟読して考えてみます。解説いただけるならお願いします。  HN:治空仙人

  • by Anonymous Coward on 2014年03月12日 10時54分 (#2561452)

    >本論と関係ない部分での画像流用が問題視されただけです。

    いちばん重要な部分の画像のねつ造が指摘されていますよ。
    だからこそ、論文撤回の検討が始まっています。

    論文を読んでいないでしょう?

typodupeerror

身近な人の偉大さは半減する -- あるアレゲ人

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